در آزمایشات PCR (واکنش زنجیره ای پلیمراز) ، بسته بندی ممکن است ساده به نظر برسد ، اما به طور مستقیم بر پایداری معرف ، سهولت استفاده و نتایج قابل اعتماد تأثیر می گذارد. این که آیا آزمایشگاه و حمل و نقل آزمایشگاه- معرفهای آماده شده یا پیش فرض های تجاری ، تسلط بر تکنیک های مناسب بسته بندی PCR می تواند از خطاهای رایج و بهبود کارایی تجربی جلوگیری کند. در زیر ، ما نکات عملی در مورد انتخاب مواد ، استراتژی های بسته بندی و جزئیات ذخیره سازی را به اشتراک می گذاریم.
I. بسته بندی انتخاب مواد: اولویت بندی سازگاری و محافظت
واکنش های PCR نسبت به دما ، نور و آلاینده ها حساس هستند ، بنابراین مواد بسته بندی باید سه مورد اصلی را برآورده کنند: مقاومت هوایی ، نور- اثبات و عدم تحرک شیمیایی.
برای لوله های سانتریفیوژ و صفحات PCR ، پلی پروپیلن (PP) ترجیح داده می شود ، به دلیل شفافیت زیاد و DNase/RNase {{0} properties رایگان {1} ml نازک {{2} tube pcr pcr ایده آل برای انتقال سریع گرما ، در حالی که 0.5 میلی لیتر مناسب است برای استریت استفاده می شود. برای صفحات PCR 96- خوب ، توصیه می کنیم یک طرح دامن (برای سهولت دستکاری روباتیک) یا یک طرح غیر داماد (برای حفاظت از فضا) انتخاب کنید.
روش آب بندی: لوله های سانتریفیوژ معمولی از کلاه های مسطح یا بلند (برای جلوگیری از تبخیر و خشک شدن) استفاده می کنند. با این حال ، برای ذخیره طولانی مدت- ، فیلم مهر و موم شده- - (مانند پارافیلم) یا فیلم قابل تنفس (مانند Aeraseal) برای تعادل فشار داخلی و خارجی توصیه می شود. صفحات PCR برای استفاده از درزگیرهای فویل آلومینیومی چسب (بالا- مقاوم در برابر دما) یا فیلم چسب خود- (برای تک {{6} استفاده) توصیه می شود.
محافظت از نور: معرفهای حاوی نور - مواد حساس (مانند رنگهای خاص یا آغازگرها) باید در فویل آلومینیومی پیچیده شوند ، یا صفحات PCR سیاه (موجود از برخی از تولید کنندگان) استفاده شود.
ii. تکنیک های اختصاصی: به حداقل رساندن تلفات ناشی از یخبندان مکرر- چرخه ذوب
معرفهای اختصاصی یک مرحله اصلی در بسته بندی PCR است و به طور مستقیم بر تکرارپذیری تجربی تأثیر می گذارد.
Master Mix Mix: مخلوط های اصلی تجاری (مانند آنزیم Taq و مخلوط DNTP) بر اساس حجم واکنش به علاوه حاشیه 5 ٪ 7} 10 ٪ (به عنوان مثال ، برای یک واکنش 20 میکرولیتر ، 22 میکرولیتر در هر لوله) توصیه می شود. از استفاده مستقیم از بسته بندی های فله خودداری کنید ، زیرا چرخه های ذوب آهسته-} می تواند منجر به کاهش فعالیت آنزیم شود (آنزیم TAQ می تواند تقریباً 5 ٪ فعالیت را در هر چرخه یخ زدگی از دست بدهد).
آغازگرها و الگوهای: آغازگرها (به ویژه آغازگرهای سفارشی) توصیه می شود از 100 راه حل سهام 100 میکرومتر اختصاص داده و در {6} 20 درجه ذخیره شود. قبل از استفاده به غلظت کار (معمولاً 0.1-1 میکرومتر) رقیق شوید. قالب هایی مانند DNA ژنومی باید به صورت تک-} از مقادیر استفاده شود تا از آلودگی متقابل استفاده شود.
نکات پیشگیری از آلودگی: اطمینان حاصل کنید که لوله های سانتریفیوژ قبل از آبشاری خشک می شوند (اتانول باقیمانده می تواند PCR را مهار کند) ، قبل از {{0} نکات پیپت خنک برای جلوگیری از چسبیدن به معرفهای سرد به دیوار ، و برای جلوگیری از آلودگی DNA پوست ، دستکش را می پوشید.
iii برچسب زدن و ضبط: از دام "جعبه سیاه" خودداری کنید
برچسب زدن شفاف برای بسته بندی PCR بسیار مهم است. برچسب زدن نادرست می تواند کل آزمایش را خراب کند.
اطلاعات برچسب زدن اجباری: نام معرف (به عنوان مثال ، "2 × Taq Mastermix") ، غلظت/محتوا (به عنوان مثال ، "10 میلی متر DNTPS") ، شماره دسته ای (برای قابلیت ردیابی) ، شرایط ذخیره سازی (به عنوان مثال ، "-20 درجه محافظت شده از نور") ، تاریخ حلال و تاریخ انقضا ("در مدت 6 ماه استفاده کنید").
برچسب زدن ویژه: اگر معرف حاوی گلیسرول (ضد یخ) ، رنگها (به عنوان مثال SYBR سبز) یا مواد افزودنی (به عنوان مثال BSA) باشد ، باید اطلاعات اضافی ارائه شود (به عنوان مثال ، "شامل 50 ٪ گلیسرول ، در دماهای بالا ذخیره نکنید").
هماهنگ سازی ضبط: توصیه می شود از یک صفحه گسترده یا نرم افزار مدیریت آزمایشگاهی (به عنوان مثال ، Labguru) استفاده کنید تا پارامترهای دقیق محتوای هر لوله (به عنوان مثال ، دنباله آغازگر ، مقدار TM) را ضبط کرده و آنها را با شماره برچسب فیزیکی مرتبط کنید.
IV ذخیره و حمل و نقل: تعادل دما و حفاظت جسمی
پایداری معرفهای PCR به شرایط ذخیره سازی بسیار وابسته است و حفاظت اضافی در هنگام حمل و نقل لازم است.
ذخیره سازی عمومی:
آنزیم ها (taq ، transcriptase معکوس): Long- ذخیره مدت در - 20 درجه (از چرخه های مکرر یخبندان خودداری کنید ؛ برای استفاده در آینده و در -80 درجه ذخیره کنید).
آغازگرها/پروب ها: بیش از 1 سال در -20 درجه ذخیره کنید (اگر حاوی یک گروه اصلاح شده مانند بیوتین باشد ، از نور محافظت کنید).
بافر آنزیم غیر - (به عنوان مثال ، PBS): ذخیره کوتاه-} ذخیره مدت در 4 درجه (حداکثر 1 ماه).
الزامات حمل و نقل:
برای حمل و نقل زنجیره ای سرد ، از یخ خشک ({3} 78 درجه) برای آنزیم ها (نگهداری شده در زیر -20 درجه) و یخ آبی (حدود 0 درجه) برای بافر برای حمل و نقل کوتاه مدت استفاده کنید.
از لرزش بیش از حد خودداری کنید (صفحات PCR باید در جعبه های فوم ایمن شوند تا از مخلوط کردن معرفها بین چاه ها جلوگیری شود).
در طول دمای زیاد تابستان ، یک لایه عایق به بسته بندی اضافه کنید (به عنوان مثال ، کیسه عایق فویل آلومینیوم + بسته ژل یخ زده).
V. مشکلات و راه حل های رایج
مشکل 1: بارش معرف (به عنوان مثال ، بارش DNTPS یا MGCL₂ در دمای پایین) → راه حل: به طور خلاصه سانتریفیوژ (1000 دور در دقیقه ، 1 دقیقه) قبل از افزایش. قبل از استفاده در یک انکوباتور 37 درجه و گرداب حل کنید تا کاملاً مخلوط شود.
مشکل 2: مهر و موم صفحه به راحتی از بین می رود → راه حل: مهر و موم مقاوم در برابر چسب را با پشتی چسب انتخاب کنید ، یا از مهر و موم گرما استفاده کنید (مناسب برای آزمایش های توان بالا {{2}).
مشکل 3: برچسب های تاری → راه حل: از یک نشانگر ضد آب (مانند یک شارپ) یا لیزر- چاپ استفاده کنید تا از پاک کردن دست نوشته ها توسط الکل جلوگیری کنید.
پایان
بسته بندی PCR چیزی بیش از معرفهای "بسته بندی" نیست. این اولین خط دفاع برای قابلیت اطمینان تجربی است. با انتخاب مواد مناسب ، استاندارد سازی فرآیند اختصاصی ، حفظ برچسب زدن کامل و حفظ کنترل دقیق دما در هنگام حمل و نقل ، می توانید خطای انسانی را به میزان قابل توجهی کاهش دهید ، و از واکنش های تقویت کننده متعاقباً پایدارتر و نتایج قابل اطمینان تر اطمینان حاصل کنید. به یاد داشته باشید: جزئیات موفقیت را تعیین می کنید. شیوه های مناسب بسته بندی PCR می تواند در کل آزمایش شما در عیب یابی زمان قابل توجهی صرفه جویی کند!